Результаты позволят облегчить разработку и производство новых лекарственных биопрепаратов
Бактериальная система является одной из наиболее простых и эффективных платформ для экспрессии рекомбинантных белков. Она экономически более выгодна по сравнению с другими методами, поэтому представляет огромный интерес не только для ученых Университета Лобачевского, но и для производителей терапевтически значимых препаратов. Однако помимо целевых рекомбинантных белков клетка продуцирует и огромное количество эндогенных, среди которых является SlyD.
Это небольшой белок, состоящий из 3 доменов. С-концевой участок богат гистидиновыми остатками, за счет чего SlyD проявляет высокое сродство к 2-валентным ионам и очищается совместно с целевыми белками в ходе металл-аффинной хроматографии, что приводит к необходимости использования дополнительных стадий очистки и как следствие, удорожанию технологического процесса получения терапевтических рекомбинантных белков.
Учеными Университета Лобачевского под руководством директора Центра молекулярной биологии и биомедицины ННГУ профессора Виктора Новикова получена серия штаммов E.coli, дефицитных по генам SlyD/SlyX. Для их получения ими был использован метод рекомбиниринга с помощью λ-red системы. Общая схема удаления генов SlyD/SlyX представлена на рисунке 1.
«Последовательность SlyD/SlyX в геноме E.coli нами была замещена геном резистентности к антибиотику канамицину, фланкированным с обеих сторон FRT-сайтами, по которым он был впоследствии удален FLP-рекомбиназой», – отмечает Виктор Новиков.
На примере рекомбинантного биспецифического белка MYSTI-2, состоящего из двух разных модулей, представляющих собой активные центры антител против мышиных белков F4/80 и TNF, ученые сравнили активность белков, выделенных из оригинальных и мутантных штаммов. В результате исследования было определено, что удаление из генома E. coli генов SlyD и SlyX, предположительно кодирующих шапероны, поддерживающих пространственную структуру белков кишечной палочки, не приводит к нарушению функциональной активности рекомбинантных белков.
Получение оригинальных штаммов E. coli позволило решить проблему контаминации рекомбинантных белков и обеспечить их успешную одноэтапную очистку с помощью металл-аффинной хроматографии.
«Полученный набор slyD/slyX-дефицитных штаммов E. coli может быть использован для получения в чистом виде широкого спектра прокариотических и эукариотических белков, в том числе медицинских терапевтических белков. Это делает более легким, простым и дешевым разработку и производство новых лекарственных и профилактических биопрепаратов», – делает вывод Виктор Новиков.
